實(shí)驗(yàn)方法原理：

       細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的基本原理是慢凍快解凍，已被證明能最大限度地提高細(xì)胞活力。目前常用甘油或二甲基亞砜作為細(xì)胞低溫保存的保護(hù)劑。這兩種物質(zhì)可以提高細(xì)胞膜對水的滲透性，再加上緩慢的冷凍可以使細(xì)胞內(nèi)的水從細(xì)胞中滲出，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少冰晶形成對細(xì)胞的損傷。復(fù)蘇細(xì)胞時應(yīng)采用快速熔融的方法，以保證細(xì)胞外晶體在短時間內(nèi)熔融，以避免因水緩慢熔融進(jìn)入細(xì)胞形成細(xì)胞內(nèi)重結(jié)晶而對細(xì)胞造成損傷。

實(shí)驗(yàn)材料：細(xì)胞

試劑、試劑盒：

       D-Hanks液 、小牛血清 、培養(yǎng)液、 青霉素、 鏈霉素、 胰蛋白酶、 HCl 、NaHCO3、 DMSO、 甘油

儀器、耗材：

微量加樣槍、吸頭、 離心管、 凍存管 、槍頭、 膠塞 、移液管玻璃瓶、 紅血球計(jì)數(shù)板、 記號筆、 醫(yī)用橡皮膏 、移液槍 、超凈工作臺 、離心機(jī) 、恒溫水浴箱、 冰箱、 倒置相差顯微鏡 、培養(yǎng)箱 、液氮冰箱

實(shí)驗(yàn)步驟：

1、細(xì)胞凍存

①10%DMSO或甘油冷凍培養(yǎng)基的制備10～20%小牛血清。

② 對數(shù)生長期細(xì)胞用胰蛋白酶消化，懸液中生長的細(xì)胞直接移到15 ml離心管。

③離心機(jī)轉(zhuǎn)速1000轉(zhuǎn)，5分鐘。

④除去胰蛋白酶和舊培養(yǎng)基，加入適量配制好的冷凍培養(yǎng)基。用吸管輕輕吹氣使細(xì)胞均勻、計(jì)數(shù)，調(diào)整凍液中細(xì)胞的最終密度為5×106/ml～1×107/ml。

⑤細(xì)胞分成深低溫保存管，每管1～1.5ml。

⑥低溫保存管上標(biāo)明細(xì)胞名稱、冷凍時間和操作人員。

⑦冷凍：標(biāo)準(zhǔn)的冷凍程序是冷卻速度為-1～-2°C/min。溫度低于-25℃時，可提高到-5°C~-10°C / min.。在-100℃時，可快速浸入液氮中。含有細(xì)胞的冷凍保存管也可以放在-20°C的冰箱里2個小時，然后放入-70°D的冰箱中過夜。取出冷凍管并將其移到液氮容器中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將冷凍管從液氮容器中取出，直接浸入37°C溫水中，并不時搖晃，使其盡快融化。

②從37°C水浴中取出凍存管，打開蓋子，用移液器吸出細(xì)胞懸液，加入離心管滴下培養(yǎng)液10倍以上，攪拌均勻。       

③離心，1000轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘。

④棄去上清液，加入10%小牛血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

⑤第二天更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

注冊事項(xiàng)：

①從增殖期到形成致密單層細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞可用于低溫保存，但優(yōu)選對數(shù)生長期細(xì)胞。冷凍前一天最好換培養(yǎng)基。

②將冷凍儲存管放入液氮容器或取出時，要做好防護(hù)工作，避免凍傷。。

③冷凍復(fù)蘇時，最好使用新配制的培養(yǎng)基。